AKUT ORTA ŞİDDETLİ HİPOBARİK HİPOKSİNİN SIÇAN MİYOKARD SOL VENTRİKÜL OKSİDATİF HASARINA ETKİSİ

Öz

Serbest radikaller hipokside oksidatif hasara neden olabilir. Bu çalışmanın amacı, akut orta şiddetli hipobarik hipoksinin genç sıçan kalp kası sol ventrikülü oksidatif hasarını incelemektir. Araştırmada dört aylık genç erkek Wistar albino sıçanları kullanıldı. Sıçanlar 6000 m yükseltide 6 saat tutuldu ve kalp kası oksidatif hasar belirteçleri olarak lipid hidroperoksid, protein karbonil, ileri oksidasyon protein ürünü, total tiol ve protein tiol düzeyleri saptandı. Genç sıçan kalp kası sol ventrikül protein karbonil ve lipid hidroperoksid düzeyleri hipoksi grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek bulundu (p<0.000). İleri oksidasyon protein ürünü için de benzer sonuç saptandı (p<0.05). Total tiol ve protein tiol düzeyleri ise hipoksi grubu kalp kası sol ventrikülünde kontrol grubundakilere kıyasla daha düşüktü (p<0.000). Protein tiol ve protein karboniller arasında yüksek negatif ilişki (r=-0.941, p<0.000) gözlendi. Bu araştırmada elde edilen bulgular, akut orta şiddetli hipobarik hipoksinin kalp kasında oksidatif hasara neden olabileceği yönündedir.

Giriş

Hipoksi; ortamdaki oksijen konsantrasyonunun az olması ya da yeteri kadar oksijenin doku/hücreye herhangi bir nedenle ulaşamama durumudur (15). Akciğerlerde O2 basıncının düşük olması, gaz değişim alanının daralması, çeşitli akciğer hastalıkları, yükseltide bulunma ve benzeri durumlar hipobarik hipoksi nedenlerindendir. Hipoksiye uyum sürecinde metabolizmada birçok değişim yaşanır. Serbest radikal oluşumunun artması bu metabolik değişimlerden biridir (13). Hipokside mitokondri, oksijen radikali oluşum merkezi haline gelmektedir (19). Diğer oksijen radikali oluşum kaynağı ise oksijenin substrat olarak kullanıldığı ekstramitokondriyal yollardır (17).

Serbest radikaller bir taraftan organizmanın hipoksik koşullara uyumunu sağlarken, diğer taraftan DNA, RNA, lipidler ve proteinlerde oksidasyona neden olarak hasara yol açabilmektedir. Hücrede, serbest radikallerle başa çıkabilecek antioksidan enzim sistemleri ve enzim dışı “non-enzimatik” işlevleri olan bazı metabolik yollar; protein tiol (P-SH) ve GSH bulunmasına rağmen, bu hasarlı ürünler hücrede her zaman yıkılamaz ve birikir (3,7).

Proteinler, serbest radikaller ile kovalent değişikliğe uğrar (26). Bu değişikliklerden bazıları serbest radikallerin protein moleküllerine direkt etkileri sonucu, bazıları da oksidasyon yan ürünlerinin proteinlere kovalent bağlanmasıyla meydana gelir. Bu etkileşim sonucunda bir çok amino asit (histidin, prolin, arjinin ve lizin gibi) kalıntısında ve/veya proteinlerin peptit omurgalarında hasar oluşmaktadır (8). Oksitlenen proteinlerin başlıca moleküler belirteçleri protein karbonil (PCO: metal katalizli protein oksidasyonu), nitrotirozin, P-SH (tiol gruplarının kaybı), ileri oksidasyon protein ürünleri (AOPP), protein hidroperoksidlerin (PrOOH) oluşumu olarak sıralanabilir (5,7,9).

Oksidatif hasara uğramış proteinlerin hücrede birikimi, proteinlerin oksidasyon ve yıkım hızını yansıtır (5). Bu nedenle PCO düzeyinin saptanması protein oksidasyonunu belirlemede duyarlı ve genel olarak kabul gören bir yöntemdir (4,6,16). Literatürde yaşlı deney hayvanları ve insan plazmasında yapılan çalışmalarında PCO düzeyi genel olarak gençlerinkinden daha yüksek bulunmuştur (4,7). PCO düzeyi hipoksi koşullarında da yüksek olarak saptanmıştır (23).

Serbest radikallerin P-SH gruplarını oksidasyonu sonucu oksidatif protein hasarı meydana gelir. Oksitlenen -SH grupları proteinlerin kendi yapısında ve/veya bir başka protein ile çapraz bağ oluşturmasına neden olur (28). Tiol gruplarının oksitlenmesi, protein oksidasyonunun en erken gözlenebilen belirtisidir (6,9). Yaşlı sıçanların iskelet kasında (6), kalp, plazma ve beyin dokusunda (4,6) yapılan çalışmada P-SH ve total tiol (T-SH) düzeylerinin genç gruba kıyasla düşük olduğu belirlenmiştir. Hipokside çalışmaları sonucunda soleus kası P-SH ve T-SH değerleri yükseltide düşüş göstermiştir.

İleri oksidasyon protein ürünlerinin (AOPP) MDA’dan daha duyarlı oksidatif stres belirteci olduğu belirtilmektedir (29). Hipoksi koşullarında ise AOPP ile ilgili sınırlı sayıda çalışma vardır. Hipoksik koşullarda insan (22) ve hayvan plazmasında (10) AOPP düzeyi yüksek bulunmuştur. Hipokside kalp dokusu AOPP düzeyini belirten bir araştırmaya ise rastlanmamıştır.
Lipit hidroperoksid (LHP) hasar belirteçleri arasında önemli bir yer tutar (1,18). Hipoksik koşullarda LHP düzeyleri farklı çalışmalarda çelişmektedir. Hipokside iskelet kası LHP artışı saptanamazken (2); kronik hipobarik hipoksisinde (5500 m) ise kalp kası, akciğer, karaciğer ve böbreklerde yüksek düzeyde MDA saptandığı bildirilmiştir (21).
LHP hücre ve mitokondri zarında oksidatif hasara neden olur. Hücre zarı hasarı protein ve DNA oksidasyonunu artırır (17,20). Protein oksidasyonu ise çok sayıda reaktif türevleri ve stabil ürünleri oluşturur (5,7,9). Bütün bu değişimler mitokondriyal hasarın ilerlemesine neden olur. Oluşan bu oksidatif hasar serisi, hücre ölümü ve doku hasarına kadar giden önemli fizyopatolojik olaylara neden olabilmektedir (17,27). Bu nedenle, hipoksi ortamında oksijene duyarlı organları incelemek kritik anlam taşır. Kalp dokusu oksijene duyarlı en önemli organlardan olduğu için, araştırmada incelenmek üzere seçilmiştir. Çalışmada akut orta şiddetli (6000 m) hipobarik hipoksinin genç sıçan kalp kası sol ventrikülünde oksidatif hasara yol açıp açmadığı sorusu, oksidatif hasar belirteçleri olan AOPP, PCO, LHP, T-SH, P-SH düzeyleri belirlenerek incelendi.

Gereç ve Yöntemler

Hayvan deneyi
Bu çalışmada, akut orta şiddetli (6000 m) hipobarik hipoksinin genç sıçanların miyokard sol venrikülü oksidatif hasarı üzerine etkilerini araştırma amacıyla 12 adet 4 aylık, 250-300 g ağırlığında erkek Wistar albino sıçanı (Başkent Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi) kullanıldı. Yükselti şiddeti Magalhaes ve ark.ın (19) yaptıkları çalışma tasarımları baz alınarak belirlendi. Hayvan deneyi için etik kurul izni 07.11.2006 tarih, 2006/65 dosya numaralı karar ve ayrıca ek hayvan kullanımı için de 09.04.2007 tarih, 2007/84 dosya numaralı karar ile Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulundan alındı.

Şıçanlar rastgele yöntemle kontrol (n=6) ve hipoksi (n=6) grubuna ayrıldılar. Hipoksi grubu doğrudan 6000 m yapay yükselti ortamında 6 saat süreyle tutuldu. Hipobarik hipoksi kabini sıçanlarda daha önce farklı amaç ve deney kurgusuyla kullanılmıştır (11). Deney bitiminde kontrol ve hipoksi grubu ketamin klorür (Ketasol 10%, Richter-Pharma, Wels, Austria) ve Ksilazin (Alfazyne 2%, Alfasan, Woerden, Netherlands) ile uyutularak feda edildi ve kalp kasları ekstrakte edildi.

Doku homojenizasyonu
Kalp kası hızla dissekte edilerek sol ventrikül izole edildi. Elde edilen doku yaklaşık 50-80 mg’lık parçalar halinde farklı tüplerin içerisine konuldu. Doku örnekleri hemen likit nitrojen ile donduruldu ve -80ºC’de saklandı. Daha sonra doku örnekleri biyokimyasal analizler için 1:21 oranında potasyum tamponu (KH2PO4-K2HPO4, 100mM, pH 7.4) ve bıçaklı homojenizatör X250D (CAD, Almanya) kullanılarak homojenize edildi. Ardından 2800g’de 4ºC’de ve 10 dk süreyle Z 323K soğutmalı santrifüjde (Hermle, Almanya) santrifüje edildi. Santrifüjleme işleminden elde edilen süpernatanlar biyokimyasal analizler için yeni tüplere aktarıldı.

Biyokimyasal analizler
Kas protein konsantrasyonunu belirlenmesi: Kas protein derişimi Bradford yöntemi kullanılarak belirlendi.

Protein karbonil gruplarının analizi: P-CO Reznik ve Packer’in 1994 yılında tanımladıkları ve Çakatay ve ark.ın (4) düzenleme yaptıkları yöntemle belirlendi. Kullanılan çözeltiler; 2.5 M HCl, 10 mM DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazin), %20’lik TCA (triklorasetik asit), %10’luk TCA, etanol- etil asetat (1:1) ve 6 M guanidin hidroklorid idi.

Total tiyol ve non-protein tiyol analizi: T-SH ve non-protein tiyol (NP-SH) Sedlak ve Lindsay’in 1968’de tanımladıkları, Çakatay ve ark.ın (6) düzenledikleri yöntemle belirlendi. Kullanılan çözeltiler; 0.01 M DNTB (5,-5’-ditio-bis-2-nitrobenzoik asit), Tris tamponu (0.2 M, pH 8.2), Tris tamponu (0.4 M, pH 8.9), %50’lik TCA idi. T-SH ile NP-SH değerleri arasındaki farktan P-SH konsantrasyonu hesaplandı.

İleri oksidasyon protein ürünlerinin analizi: AOPP, Witko-Sarkat ve ark.ın (29) tanımladıkları ve Kayalı ve ark.ın (16) düzenleme yaptıkları yöntemle belirlendi. Kullanılan çözeltiler; fosfat tamponu (pH 7.4), potasyum iyodid (1.16 M), asetik asit (%100) idi. Chloramin-T eşitliği dikkate alınarak AOPP düzeyleri hesaplandı.

Lipit hidroperoksitlerin analizi: LHP, Wolff’un 1994 yılında tanımladığı, Çakatay ve ark.ın (6) düzenleme yaptıkları yönteme göre saptandı. FOX-2 reaktifi hazırlamak için kullanılan çözeltiler; ksilenol oranj (100 μM), amonyum ferro sülfat (250 μM), methanol (%90, HPLC-grade), bütil hidroksitoluen (4 mM) ve sülfirik asit (25 mM) idi.

İstatistiksel analiz
Kontrol ve 6000 m hipobarik hipoksi sıçanların sol ventrikülünden elde edilen AOPP, LHP, TSH, PCO ve PSH oksidatif hasar değişkenleri değerleri arasındaki farklılıklar SPSS v15.0 istatistik programı ile incelendi. Analizler hem Kruskal-Wallis non-parametrik ANOVA, Mann-Whitney U-testi ile; hem de deney gruplarının normal dağılım göstermesi ve varyansların homojen olması nedeni ile de Student t-testi ile yapıldı. Bulgularda Student t-testi sonuçları kullanıldı. Ayrıca PCO ve PSH arasındaki ilişki Pearson korrelasyonu ile belirlendi. Analizler için istatistiksel anlamlılık sınırı özellikle belirtilmemişse, p<0.000 olarak kabul edildi.

Bulgular

Çalışmada akut orta şiddetli hipobarik hipoksinin genç sıçan kalp kası sol venrikülünde yol açtığı oksidatif hasar düzeylerine ilişkin değişkenlerin değerleri ortalama ± SS olarak Tablo 1’de verilmektedir.

Akut orta şiddetli hipobarik hipoksinin (HH) genç sıçan kalp kası sol venrikülünde yol açtığı oksidatif hasara ilişkin değişkenlere etkisi Tablo 1’de verilmektedir. Çalışmada (HH) grubunun sol ventrikülünde oksidatif hasar değişkenlerinden AOPP (p<0.048), LHP ve PCO (Şekil 1) (her ikisi p<0.000) düzeyleri kontrol grubundaki düzeylerden istatistiksel açıdan daha yüksek saptandı. PSH (Şekil 2) ve TSH parametrelerinin düzeyleri ise kontrol grubunda yüksekti (p<0.000). İki grubun toplamı için PCO ve PSH arasındaki korrelasyon analizinde ise, yüksek negatif (r=-0.941, p<0.000) ilişki gözlendi (Şekil 3).

Tartışma

Metabolizma için bazı koşullarda (hiperoksi, UV vb.) olduğu gib hipoksi koşullarında da redoks dengesizliği söz konusudur ve normalden daha fazla serbest radikal oluşur (19). Oluşan radikaller başta makro moleküller olmak üzere mitokondriyal hasar, hücre ölümü ve hatta doku hasarına kadar gidebilen önemli olaylara neden olabilmektedir (12). Aterosklerozis gibi hipoksi koşullarına benzerlik gösterdiği belirtilen hastalıkların ana mekanizmalarının altında yatan temel nedenlerden birinin serbest radikaller olduğu bilinmektedir (25,27).

Çalışmadan elde edilen bulgular; orta şiddetli akut hipobarik hipoksinin genç sıçan myokard sol venrikülünde oksidatif hasara yol açabileceği yönündedir. Akut orta şiddetli hipobarik hipoksili sıçan miyokard sol ventrikülünde PCO oluşumu, kontrol grubununkinden anlamlı düzeyde yüksek bulundu. Bu bulgu literatür ile koşutluk göstermektedir. Hipobarik hipoksi koşullarında yapılan bir araştırmada, dört hafta süre ile günde bir saat yaptırılan egzersizde sıçanların quadriceps kası kırmızı bölgesinde PCO düzeylerinde artış saptanmıştır (23). Diğer bir çalışmada; radikal hasarının, 4000-5000 m yükseltide yapılan kısa süreli düşük yoğunluktaki egzersizden daha çok hipoksiden kaynaklandığı belirtilmiştir (24). Yine akut şekilde 8500 m yükseltide bırakılan 10 haftalık erkek farelerin iskelet kası mitokondriyal PCO düzeylerinin kontrol grubuna göre artış gösterdiği saptanmıştır (19).

Araştırmada AOPP, hipoksi grubu kalp kası sol ventrikülünde kontrol grubu hayvanlarınkine göre daha yüksek düzeyde saptandı. Her ne kadar literatürde hipokside, sıçan miyokard sol ventrikülünde bir oksidatif protein hasar parametresi olan AOPP ile ilgili çalışmaya rastlanmasa da, hipokside farklı dokularda AOPP parametresi ile ilgili sınırlı sayıda çalışmaya rastlanmaktadır. Buradaki bulgu, bir çalışma ile benzerlik göstermektedir: insan plazmasında AOPP düzeyi belirlenmiş ve normoksik koşullara göre yüksek bulunmuştur (22). Buna karşın Devi ve ark. (10) ise 5700 m ve 6300 m yükseltilerde yaptıkları çalışmada, hipoksi grubunun plazma AOPP düzeyleriyle kontrol grubunda elde edilenler arasında fark saptamamışlardır. Devi ve çalışma grubunun bulguları ile burada elde edilen bulguların benzer yönde sonuç vermemesi, çalışma tasarımları ve kullanılan doku farklılıkları ile ilgili olabilir.

Hipoksik ortamda protein tiyollerinin oksidasyona uğradığı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (10,19). Bu çalışmalardaki soleus kası T-SH değerlerinin hipoksik ortamda azalması, kalp dokusunda burada elde edilen bulgularla benzeşmektedir. Kontrol grubu sol ventrikülünde P-SH ve T-SH düzeyleri hipoksi grubundakilere göre istatistiksel olarak daha yüksek bulundu. Farklı çalışmalarda P-SH ve/veya T-SH değerleri ile PCO değerleri arasında yüksek negatif korrelasyon elde edilmiştir (7). Buradaki çalışmada da gruplarda P-SH ve PCO arasında yüksek negatif korrelasyon saptandı. Bulgular hipobarik hipoksi grubunda P-SH ve T-SH’nin antioksidan olarak görev yaptığı ve proteinleri oksitlenmeden koruyarak PCO oluşumunu geciktirebileceği ya da engelleyebileceği yönündedir.

Son derece reaktif olan peroksinitrit, tirozin amino asidiyle tepkimeye girerek nitrotirozini oluşturmaktadır. Nitrotirozin önemli bir oksidatif protein hasarı belirtecidir. Her ne kadar hipoksik koşullarda NO’nun azaldığını gösteren çalışmalar varsa da, NO hipoksik koşullara uyum için ilk sentezlenen moleküllerdendir ve derişimi belli bir düzeyin üzerine çıktığında ciddi radikal hasarına neden olur (14). Ayrıca akut hipobarik hipokside NO’nun toksik etkilerini gösterme olasılığı kronik hipoksiye göre daha güçlüdür. Bu çalışmada nitrotirozin düzeyi belirlenmemiş olmakla birlikte, bulgular; yükseltide akut orta şiddetli hipobarik hipokside artan kalp kası sol ventrikül protein karbonil, AOPP ve LHP düzeyleri ile, azalan P-SH ve T-SH düzeyleri aracılığında miyokard sol ventrikül oksidatif protein ve lipid hasarındaki artışın göstergeleri olabileceklerini ortaya koymaktadır.

Kaynaklar

1. Arab K, Steghens JP: Plasma lipid hydroperoxides measurement by an automated xylenol orange method. Anal Biochem 325: 158-63, 2004.
2. Bailey DM, Castell LM, Newsholme EA, Davies B: Continuous and intermittent exposure to the hypoxia of altitude: implications for glutamine metabolism and exercise performance. Br J Sports Med 34: 210-2, 2000.
3. Clanton TL: Hypoxia-induced reactive oxygen species formation in skeletal muscle (Review). J Appl Physiol (1985) 102: 2379-88, 2007.
4. Çakatay U, Kayalı R, Sivas A, Tekeli F: Prooxidant activities of alpha-lipoic acid on oxidative protein damage in the aging rat heart muscle. Arch Gerontol Geriatr 40: 231-40, 2005.
5. Çakatay U, Telci A: Oksidatif protein hasarı ve saptanmasında kullanılan marker’lar. İstanbul Tıp Fakültesi Dergisi 63: 314-7, 2000.
6. Çakatay U, Telci A, Kayalı R, Tekeli F, Akçay T, Sivas A: Relation of aging with oxidative protein damage parameters in the rat skeletal muscle. Clin Biochem 36: 51-5, 2003.
7. Çakatay U, Telci A, Yılmaz İA, Akçay T, Sivas A: Yaşlanmanın plazma oksidatif protein hasarına etkisi. Cerrahpaşa Tıp Dergisi 31: 220-3, 2000.
8. Dalle-Donne I, Giustarini D, Colombo R, Rossi R, Milzani A: Protein carbonylation in human diseases (Review). Trends Mol Med 9: 169-76, 2003.
9. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R: Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta 329: 23-38, 2003.
10. Devi SA, Vani R, Subramanyam MV, Reddy SS, Jeevaratnam K: Intermittent hypobaric hypoxia-induced oxidative stress in rat erythrocytes: protective effects of vitamin E, vitamin C, and carnitine. Cell Biochem Funct 25: 221-31, 2007.
11. Du J, Gebicki JM: Proteins are major initial targets of hydroxyl free radicals. Int J Biochem Cell Biol 36: 2334-43, 2004.
12. Eaton P: Protein thiol oxidation in health and disease: techniques for measuring disulfides and related modifications in complex protein mixtures (Review). Free Radic Biol Med 40: 1889-99, 2006.
13. Földes-Papp Z, Domej W, Demel U, Tilz GP: Oxidative stress caused by acute and chronic exposition to altitude. Wien Med Wochenschr 155(7-8): 136-42, 2005.
14. Halliwell B, Zhao K, Whiteman M: Nitric oxide and peroxynitrite. The ugly, the uglier and the not so good: a personal view of recent controversies (Review). Free Radic Res 31: 651-69, 1999.
15. Hochachka PW: Mechanism and evolution of hypoxia-tolerance in humans (Review). J Exp Biol 2001: 1243-54, 1998.
16. Kayalı R, Çakatay U, Uzun H, Genç H: Gender difference as regards myocardial protein oxidation in aged rats: male rats have increased oxidative protein damage. Biogerontology 8: 653-61, 2007.
17. Kulkarni AC, Kuppusamy P, Parinandi N: Oxygen, the lead actor in the pathophysiologic drama: enactment of the trinity of normoxia, hypoxia, and hyperoxia in disease and therapy. Antioxid Redox Signal 9: 1717-30, 2007.
18. Liu H, Lightfoot R, Stevens JL: Activation of heat shock factor by alkylating agents is triggered by glutathione depletion and oxidation of protein thiols. J Biol Chem 271: 4805-12,1996.
19. Magãlhaes J, Ascensão A, Soares JMC, et al: Acute and severe hypoxia increases oxidative stress and impairs mitochondrial function in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol (1985) 99: 1247-53, 2005.
20. Matés JM, Pérez-Gómez C, Núñez de Castro I, Asenjo M, Márquez J: Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death (Review). Int J Biochem Cell Biol 34: 439-58, 2002.
21. Nakanishi K, Tajima F, Nakamura A, et al: Effect of hypobaric hypoxia on antioxidant enzymes in rats. J Physiol 489: 869-876, 1995.
22. Pialoux V, Mounier R, Ponsot E, et al: Effects of exercise and training in hypoxia on antioxidant/pro-oxidant balance. Eur J Clin Nutr 60: 1345-54, 2006.
23. Radak Z, Asona K, Lee KC, et al: High altitude increases reactive carbonyl derivatives but not lipid peroxidation in skeletal muscle of rats. Free Radic Biol Med 22: 1109-14, 1997.
24. Rodríguez FA, Casas H, Casas M, et al: Intermittent hypobaric hypoxia stimulates erythropoiesis and improves aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc 31: 264-8, 1999.
25. Schrauwen P, Hesselink MK: Oxidative capacity, lipotoxicity, and mitochondrial damage in type 2 diabetes (Review). Diabetes 53: 1412-7, 2004.
26. Shacter E: Protein oxidative damage. Methods Enzymol 319: 428-36, 2000.
27. Stadtman ER: Role of oxidant species in aging (Review). Curr Med Chem 11: 1105-12, 2004.
28. Stadtman ER, Levine RL: Protein oxidation (Review). Ann N Y Acad Sci 899: 191-208, 2000.
29. Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillère-Blandin C, et al: Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney Int 49: 1304-13, 1996.

Araştırmamızın biyokimyasal analizlerinde, gerek deneyimiyle, gerekse bilgisiyle bizden yardımlarını esirgemeyen Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri Bölümü, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Ufuk Çakatay’a teşekkür ederiz.